方案概述
前言：
黄曲霉毒素 B₁是由黄曲霉、寄生曲霉产生的强毒性次生代谢产物，在黄曲霉毒素家族中毒性最强、分布最广。它通过抑制细胞内 DNA 与 RNA 合成、干扰蛋白质代谢发挥毒性，且对肝脏有高度靶向损伤作用。相较于赭曲霉素、展青霉素等其他真菌毒素，黄曲霉毒素 B₁毒性极强、致癌性明确，已被被世界卫生组织列为 Ⅰ 类致癌物，在花生、玉米、坚果、植物油等粮油作物中容易检出，是全球食品安全重点防控的污染物。黄曲霉毒素 B₁的污染多因粮油作物在种植、收获、储存时，遇到高温高湿环境导致真菌滋生，且其化学性质稳定，常规烹饪温度无法将其破坏，使得农产品及加工食品中残留问题频发。这种残留危害显著：短期摄入高剂量会引发急性中毒，出现剧烈腹痛、呕吐、黄疸、肝衰竭等症状，严重时可致死亡；长期低剂量摄入则会在肝脏蓄积，诱发慢性肝损伤，如肝纤维化、肝硬化，甚至引发原发性肝癌，儿童、老人及肝病患者等免疫力较低人群中毒风险更高。
我国《GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》明确了各类食品中黄曲霉毒素 B₁的最大残留限量，《GB 5009.22-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素 B 族和 G 族的测定》也给出黄曲霉毒素 B₁检测方法。本应用方案介绍了利用英国365集团官网 LCMS-TQ9200 液质联用系统建立黄曲霉毒素 B₁的同位素稀释液相色谱-串联质谱法检测方法。
关键词：LCMS-TQ9200；黄曲霉毒素B₁；同位素稀释液相色谱-串联质谱法 。
1.仪器设备及试剂
1.1 仪器配置
表1 仪器配置清单表
序号 | 名称 | 数量 |
1 | LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统 | 1台 |
2 | P3600 二元高压恒流泵 | 1台 |
3 | CT3600 柱温箱 | 1台 |
4 | AS3600 超高效自动进样器 | 1台 |
5 | SmartLab CDS 2.0色谱使用工作站 | 1套 |
6 | C18 1.7 μm 2.1x50 mm | 1个 |
1.2 试剂及标准品清单
表2 试剂及标品清单表
序列 | 试剂及标准品 | 纯度 |
1 | 甲醇 | LC-MS级 |
2 | 乙腈 | LC-MS级 |
3 | 乙酸铵 | LC-MS级 |
4 | 黄曲霉毒素B₁ | 100 ppm |
5 | 13C17-黄曲霉毒素B₁ | 25 ppm |
1.3 实验材料及辅助设备
涡旋混合器；高速离心机；分析天平；离心机；固相萃取装置（带真空泵）；氮吹仪；摇床。
2.实验方法
2.1溶液配制
2.1.1 5 mmol/L乙酸铵溶液：称取0.39 g乙酸铵，用水溶解后稀释至1000 mL，摇匀。
2.1.2 甲醇-乙腈溶液：取100 mL乙腈加入100 mL甲醇，摇匀。
2.2 样本前处理
2.2.1 样品提取
取小麦粉过2 mm孔径试验筛，称取5ｇ试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入100 μＬ同位素内标工作液（100 ng/mL)振荡混合后静置30 min。加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），涡旋混匀，摇床中振荡20 min，在6000 r/min下离心10 min，取上清液备用。
2.2.2 样品净化
准确移取4 mL上清液，加入23 mL 1% Trition X-100的PBS，混匀。
待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1~3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入2×10 mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置10 mL刻度试管，取下50 mL的注射器筒，加入２×１mL甲醇洗脱亲和柱，控制1~3 mL/min的速度下滴，再用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.22 μｍ滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待进样。
2.3 实验条件
2.3.1 液相方法条件
色谱柱：C18 1.7 μm 2.1x50 mm
流动相：A相：甲醇-乙腈溶液；B相：5 mmol/L乙酸铵溶液；流速：0.3 mL/min
柱温：40 ℃
进样体积：3 µL
2.3.2 质谱方法条件
表3 化合物质谱参数
化合物 | 母离子 | 子离子 | 碰撞能量CE |
黄曲霉毒素B₁ | 313.0 | 285.0* | 35.0 |
241.0 | 40.0 | ||
13C17-黄曲霉毒素B₁ | 330.1 | 301.1* | 32.0 |
255.1 | 54.0 |
注：带*为定量离子
3.实验结果
3.1 标准品谱图
5分钟内完成黄曲霉毒素B₁和同位素内标13C17黄曲霉毒素B₁的测定，如图1 化合物峰有良好的峰形，其响应良好，符合实验测定需求。
图1 黄曲霉毒素B₁和同位素内标13C17黄曲霉毒素B₁的色谱图
3.2 线性范围
准确移取适量标准工作溶液和混合同位素内标工作溶液，用初始流动相配制成黄曲霉毒素B₁浓度为50，20，10，5，2，1，0.5 ng/mL浓度的系列标准工作液，其中包含2 ng/mL的同位素内标并制作标准曲线，线性范围0.5-50 ng/mL，以13C17黄曲霉毒素B₁作为内标校正后，黄曲霉毒素B₁线性结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²为0.998，线性关系良好。
图2 黄曲霉毒素B₁标准曲线
3.3 重复性
取1、10、20 ng/mL三种浓度标准溶液，连续进样6针。结果如下表所示，高中低浓度黄曲霉毒素B₁保留时间，样品量的相对标准偏差均在5%以内，满足实验要求。
表4 高中低浓度黄曲霉毒素B₁重复性测试
化合物 | 浓度(ng/mL) | 保留时间RSD（%） | 样品量RSD（%） |
黄曲霉毒素B₁ | 1 | 0.718 | 3.379 |
10 | 0.670 | 1.216 | |
20 | 0.544 | 1.749 |
3.4 加标回收
在样品中加入黄曲霉毒素B₁标准溶液，使其浓度达到5 ng/mL，进液质测试，连续6针测试结果平均值为5.147 ng/mL，RSD为1.954%，回收率为102.94%，符合实验要求。
3.5 空白残留
在连续进样20 ng/mL标液后，接着进空白样检测计算空白残留，结果如图3，空白残留未检出。
图3 化合物空白色谱图
3.6 样品测定
样品A（图4）未检出黄曲霉毒素B₁。
图4 样品A的黄曲霉毒素B₁色谱图
4.结论
本方法使用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相质谱联用系统建立黄曲霉毒素 B₁的同位素稀释液相色谱-串联质谱法检测方法。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合实验要求，R²为0.998，符合线性要求，高中低浓度的重复性在5%以内，高浓度样本无系统残留，说明了该方法配备英国365集团官网液相色谱质谱联用系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。
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