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英国365集团官网离子色谱测定婴幼儿配方乳粉中2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量

方案概述

前言：

母乳低聚糖（HMOs）是母乳中天然存在的聚合度不高于3的低聚糖的统称，也是母乳中第三大固体组成成分，仅次于乳糖和脂肪。其具有调节肠道菌群，尤其是促进双歧杆菌科在婴幼儿肠道中定植的作用，同时还具有维持肠道健康，促进免疫系统和大脑发育，抗感染等多种生理功能，在婴幼儿生长发育中发挥着重要的作用。

自2015年第一款加入母乳低聚糖的婴幼儿配方食品在美国上市以来，全球各地均有大量添加了母乳低聚糖的婴幼儿配方食品、乳及乳制品、消化健康相关的膳食补充剂与功能性食品在售，我国也已批准将2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖这两种母乳低聚糖作为食品营养强化剂添加到婴幼儿配方乳粉中。

在目前常用的检测母乳低聚糖的方法中，液相色谱法需先进行衍生反应才能进行检测，前处理过程复杂且衍生剂往往具有毒害性；而母乳低聚糖不耐热的特点又使液相色谱-质谱联用法的响应低重复性差。相较之下使用安培检测器测试糖类物质的离子色谱法前处理简单，响应高且重复性好，在母乳低聚糖检测中有明显的优势。

本应⽤方案手配氢氧化钠溶液，乙酸钠溶液和纯水为淋洗液，使用英国365集团官网IC6300离子色谱仪检测婴幼儿配方乳粉中2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量。该方法前处理过程简单，灵敏度高，线性良好，为食品中母乳低聚糖的检测提供了很好的参考。

关键词：离子色谱仪、母乳低聚糖、安培检测器。

1.仪器设备及试剂

1.1 试剂及标准品清单

表1 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	50%氢氧化钠溶液	分析级
2	乙酸	分析级
3	乙酸钠	99%
4	淀粉葡萄糖苷酶(来自黑曲霉，CAS号9032-08-0)，液化型	酶活力单位≥10万u/mL
5	2’-岩藻糖基乳糖	95%
6	乳糖-N-新四糖	95%

1.2 实验材料及辅助设备

万分之一天平；

水浴锅；

水系聚醚砜滤膜（0.45µm）；

超纯水；

抽滤装置；

pH计；

C18前处理小柱；

一次性注射器（20mL、5mL）。

2.实验方法

2.1 溶液配置

2.1.1 200mmol/L NaOH溶液: 取50%氢氧化钠10.5mL，水溶解稀释到1000mL，真空抽滤。

2.1.2 480mmol/L乙酸钠溶液：准确称量39.374g乙酸钠固体，加水溶解转移到1000mL容量瓶中，定容到1000mL，真空抽滤。

2.1.3 0.2mol/L乙酸钠溶液：准确称量8.203g乙酸钠固体，加水溶解转移到500mL容量瓶中，用乙酸调pH值至4.5±0.1定容到500mL。

2.1.4 3%乙酸溶液: 精准移取3mL乙酸，加水溶解稀释到100 mL。

2.1.5 淀粉葡萄糖苷酶溶液（70 U/mL）：根据酶活性，用乙酸钠溶液（0.2 mol/L）溶解淀粉葡萄糖苷酶，制备成最终浓度为70 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶溶液。临用现配。

2.1.6 混合标准中间液：取1000mg/L 2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖标准溶液1.5mL至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为150mg/L的混合标准中间液，现配现用。

2.1.7 混合标准工作液：准确移取混合标准中间液（2.1.6）于容量瓶中，用水稀释成质量浓度分别为1mg/L，2mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，50mg/L的2’-岩藻糖基乳糖和0.3mg/L，0.6mg/L，1.5mg/L，3mg/L，6mg/L，15mg/L的乳糖-N-新四糖混合标准工作液，现配现用。

2.2 样本前处理

2.2.1 试样制备

称取试样12.5g（m1，精确至0.01g）于250 mL锥形瓶中，加入温水（45℃）100 g（m2，精确至0.01g），充分混匀溶解，即得冲调好的复原乳。冷却后准确移取约10 g（m3，精确至0.01g）冲调后的复原乳，加水至50 g（m4，精确至0.01g），混匀备用。

2.2.2 试样前处理

称取1g试样溶液（m5，精确至0.01g）置于10mL比色管中，加入100µL淀粉葡萄糖苷酶乙酸钠溶液，涡旋至充分混匀。将比色管置于60℃水浴中保温60min后取出，沸水浴5min，冷却至室温，加入0.2mL 3%乙酸溶液，用水定容至刻度，混匀备用。

试样质量m的计算公式如下：

2.2.3 净化

试样溶液依次过0.45 µm水系微孔滤膜和固相萃取小柱，弃去前3 mL，收集后续的洗脱液待测。C18固相萃取小柱使用前依次用20mL甲醇、15 mL水通过，静置活化30min。

2.3 实验条件

2.3.1 离子方法条件

色谱柱	糖分析柱
淋洗液	纯水、200mM NaOH、480mM乙酸钠梯度淋洗
运行时间	60 min
检测器	金电极，糖类，四电位

3.实验结果

3.1 线性范围

取适量各浓度混合标准工作液上机测试，线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²范围在0.999以上，各组分线性关系良好。

表2各化合物线性范围表

化合物	线性范围	决定系数R²
2’-岩藻糖基乳糖	1~50mg/L	0.99987
乳糖-N-新四糖	0.3~15mg/L	0.99995

图2 2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖标曲重叠谱图

2’-岩藻糖基乳糖

乳糖-N-新四糖

3.3 样品测试结果

取稀释5倍的样品1、样品2进行测试，试样中2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量按如下公式计算：

式中：

X——待测样品中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量，单位为mg/100g；

Ρ——由标准曲线得到的待测样品溶液中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——定容体积，单位为mL；

m——试样质量，单位为g；

f ——稀释倍数；

经计算得到样品中2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖的含量，单位为mg/100g，结果如下：

图2 样品1稀释5倍测试离子谱图

图3 样品2稀释5倍测试离子谱图

表3 样品测试结果

定容体积

/mL

称样量

m1/g

加入温水的量

m2/g

移取复原乳的量m3/g

加水稀释后复原乳的量m4/g

称取试样的量m5/g

稀释倍数

试样质量m/g

2'-岩藻糖基乳糖浓度(mg/L)

乳糖-N-新四糖浓度(mg/L)

2'-岩藻糖基乳糖含量(mg/100g)

乳糖-N-新四糖含量(mg/100g)

2-1

12.5059

100.148

10.0434

50.0995

1.0024

0.0223

n.a.

1.1970

n.a.

268.2916

2-2

12.5059

100.148

10.0434

50.0995

1.0093

0.0225

n.a.

1.0230

n.a.

227.7242

3.4 精密度和正确度

取混合标准工作曲线第1点、第5点和第6点的工作液，以及稀释5倍的样品1溶液，在2.3.1的仪器条件下连续进6针测定，结果如下，方法精密度和正确度良好。

3.4.1 标准品重复性精密度

测试结果：

图4 标曲S1平行独立试验重叠谱图

图5 标曲S5平行独立试验重叠谱图

图6 标曲S6平行独立试验重叠谱图

表4 标准品重复性精密度

样品	S1		S5			S6
样品	保留时间	样品量	保留时间	样品量	保留时间		样品量
2’-岩藻糖基乳糖RSD%	0.397	0.655	0.038	0.104	0.524		1.291
乳糖-N-新四糖RSD%	0.732	1.8	0.101	0.238	0.492		1.356

3.4.2 样品重复性精密度和正确度

测试结果：

图7 样品1稀释5倍平行独立试验重叠谱图

表5 样品1稀释5倍重复性精密度

样品	2’-岩藻糖基乳糖			乳糖-N-新四糖
	保留时间	样品量	保留时间		样品量
RSD%	0.251	n.a.	0.384		0.556

3.5 加标回收率

分别取20µL、40µL、100µL的2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖标准溶液加入10mL容量瓶中，用稀释20倍的样品1定容至刻度，得到加标2ppm、4ppm、10ppm的稀释20倍的样品1溶液，摇匀，上机测试，测试结果如下。

图8 稀释20倍的样品1及加标2ppm，4ppm，10ppm的测试谱图

注：由上往下分别为稀释20倍的样品1，加入2ppm标准品，加入4ppm标准品，加入10ppm标准品的谱图

表7 2’-岩藻糖基乳糖加标回收率

样品名称	样品量	信噪比	分离度	加标回收率
样1 D20	n.a.	6.915	7.927	/
2-1+2ppm	1.921	1643.669	7.688	96.05%
2-1+4ppm	4.017	2930.519	7.546	100.43%
2-1+10ppm	9.978	4521.914	7.406	99.78%

表8 乳糖-N-新四糖加标回收率

样品名称	样品量	信噪比	分离度	加标回收率
样2-1 D20	0.211	131.207	n.a.	/
2-1+2ppm	2.095	1205.435	n.a.	94.20%
2-1+4ppm	4.412	2088.863	n.a.	105.03%
2-1+10ppm	10.457	3089.838	n.a.	102.46%

3.6 检出限定量限

测试结果如下：

表9 检出限定量限测试结果

待测物质	检出限（µg/L）	定量限（µg/L）	检出限信噪比	检出限保留时间(min)	定量限信噪比	定量限保留时间(min)
2'-岩藻糖基乳糖	4	10	8.326	10.975	24.285	11.017
乳糖-N-新四糖	8	20	9.988	17.817	28.753	18.067

4.结论

本方法使用英国365集团官网IC6300离子色谱系统配置安培检测器，使用糖分析柱（3x150mm）测定溶解并经淀粉酶处理后的样品中2’-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖的含量由色谱图和数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合国标要求，线性相关系数均大于0.999，混合标准工作液和样品检测结果精密度良好，检出限和定量限良好。说明了该方法配备英国365集团官网离子色谱系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。

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