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方案概述

前言：

母乳低聚糖（HMOs）是母乳中天然存在的聚合度不高于3的低聚糖的统称，也是母乳中第三大固体组成成分，仅次于乳糖和脂肪。其具有调节肠道菌群，尤其是促进双歧杆菌科在婴幼儿肠道中定植的作用，同时还具有维持肠道健康，促进免疫系统和大脑发育，抗感染等多种生理功能，在婴幼儿生长发育中发挥着重要的作用。

自2015年第一款加入母乳低聚糖的婴幼儿配方食品在美国上市以来，全球各地均有大量添加了母乳低聚糖的婴幼儿配方食品、乳及乳制品、消化健康相关的膳食补充剂与功能性食品在售，截至2023年6月1日，美国和欧盟已批准2'-岩藻糖基乳糖，3'-岩藻糖基乳糖，乳糖二岩藻糖基乳糖，乳糖-N-新四糖，乳糖-N-四糖，3'-唾液乳糖和6'-唾液乳糖共7种HMOs的应用。我国也已批准将2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖这两种母乳低聚糖作为食品营养强化剂添加到婴幼儿配方乳粉中。

在目前常用的检测母乳低聚糖的方法中，液相色谱法需先进行衍生反应才能进行检测，前处理过程复杂且衍生剂往往具有毒害性；而母乳低聚糖不耐热的特点又使液相色谱-质谱联用法的响应低重复性差。相较之下使用安培检测器测试糖类物质的离子色谱法前处理简单，响应高且重复性好，在母乳低聚糖检测中有明显的优势。

本应⽤方案手配氢氧化钠溶液，乙酸钠溶液和纯水为淋洗液，使用英国365集团官网IC6300离子色谱仪检测婴幼儿配方乳粉中母乳低聚糖的含量。该方法前处理过程简单，灵敏度高，线性良好，为食品中母乳低聚糖的检测提供了很好的参考。

关键词：离子色谱仪；母乳低聚糖；安培检测器。

1.仪器设备及试剂

1.1 试剂及标准品清单

表1 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	50%氢氧化钠溶液	分析级
2	甲醇	分析级
3	5-磺基水杨酸	优级纯
4	乙酸钠	99%
5	2'-岩藻糖基乳糖	98%
6	3'-岩藻糖基乳糖	95%
7	乳糖二岩藻糖基四糖	95%
8	乳糖-N-新四糖	90%
9	乳糖-N-四糖	95%
10	3'-唾液乳糖	90%
11	6'-唾液乳糖	98%
12	葡萄糖	99%
13	果糖	99%
14	蔗糖	99%
15	麦芽糖	99%

1.2 实验材料及辅助设备

1.2.1万分之一天平；

1.2.2恒温水浴锅；

1.2.3离心机；

1.2.4水系聚醚砜滤膜（0.45µm）；

1.2.5超纯水；

1.2.6抽滤装置；

1.2.7 RP前处理小柱；

1.2.8一次性注射器（20mL、5mL）。

2.实验方法

2.1 溶液配置

2.1.1 200mmol/L氢氧化钠溶液：取50%氢氧化钠10.5mL，水溶解稀释到1000mL，真空抽滤。

2.1.2 75mmol/L氢氧化钠与250mmol/L乙酸钠混合溶液：准确称量20.51g乙酸钠固体，加水溶解转移到1000mL容量瓶中，再准确移取3.95mL50%氢氧化钠溶液，用超纯水定容到1000mL，真空抽滤。

2.1.3 3%磺基水杨酸溶液：称取3.0g磺基水杨酸，加水溶解并定容至100 mL（现配现用）。

2.14混合标准储备液：准确称取2'-岩藻糖基乳糖、3'-岩藻糖基乳糖、3'-唾液乳糖、6'-唾液乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖各5 mg（精确至0.1 mg），置于10 mL 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配置成500mg/L的混合标准储备液；准确移取乳糖二岩藻糖基四糖1mg（精确至0.1 mg），置于10 mL 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配置成100mg/L的混合标准储备液。

2.1.5 混合标准工作液：准确移取混合标准储备液（2.1.4）于容量瓶中，用水稀释成质量浓度分别为0.5mg/L，2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L的2'-岩藻糖基乳糖、3'-岩藻糖基乳糖、3'-唾液乳糖、6'-唾液乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖和乳糖二岩藻糖基四糖混合标准工作液，现配现用。

2.2 样本前处理

称取样品约2.0 g，置于小烧杯中，用50 mL温水（约50℃），使样品充分混匀，加入40 mL 3% 磺基水杨酸溶液，转移定容至100 mL容量瓶中，超声10 min，溶液经滤纸过滤或者离心处理（12000r/min，15 min）。试样溶液依次过0.45 µm水系微孔滤膜和固相萃取小柱，弃去前3 mL，收集后续的洗脱液待测。RP固相萃取小柱使用前依次用20mL甲醇、15 mL水通过，静置活化30min。

2.3 实验条件

2.3.1 离子方法条件

色谱柱	糖分析柱，4.0×250mm
淋洗液	纯水、200mM NaOH、75mM NaOH+250mM乙酸钠梯度淋洗
流速	1.0mL/min
运行时间	90 min
进样量	满环进样，10μL
柱温	20℃
检测区温	30℃
检测器	安培检测器，金电极，糖类，四电位

3.实验结果

3.1 线性范围

取适量各浓度混合标准工作液上机测试，线性范围0.5~10mg/L，线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²范围在0.999以上，各组分线性关系良好。

表1 各化合物线性范围表

化合物	线性范围	决定系数R²
3'-岩藻糖基乳糖	0.5~10mg/L	0.99943
乳糖二岩藻糖基乳糖	0.5~10mg/L	0.99943
2'-岩藻糖基乳糖	0.5~10mg/L	0.99946
乳糖-N-新四糖	0.5~10mg/L	0.99997
乳糖-N-四糖	0.5~10mg/L	0.99950
6'-唾液乳糖	0.5~10mg/L	0.99954
3'-唾液乳糖	0.5~10mg/L	0.99958

图1 七种母乳低聚糖标曲重叠谱图

3.2 样品测试结果

取稀释10倍的样品1、样品2进行测试，试样中七种母乳低聚糖含量按如下公式计算：

式中：

X——待测样品中七种母乳低聚糖的含量，单位为mg/100g；

c——由标准曲线得到的待测样品溶液中七种母乳低聚糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——定容体积，单位为mL；

m——试样称样量质量，单位为g；

f ——稀释倍数；

经计算得到样品中七种的含量，单位为mg/100g，结果如下：

图2 样品1稀释10倍测试离子谱图

图3 样品2稀释10倍测试离子谱图

表2 样品测试结果

	待测物质	保留时间(min)	峰面积(nC*s)	样品量(mg/L)	信噪比	稀释倍数	定容体积(mL)	称样量(g)	实际含量(mg/100g)
样品1	3'-岩藻糖基乳糖	8.342	116.853	n.a.	85.373	10	100	1.9872	n.a.
	乳糖二岩藻糖基四糖	10.125	309.784	0.503	177.966	10	100	1.9872	25.31
	2'-岩藻糖基乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.9872	n.a.
	乳糖-N-新四糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.9872	n.a.
	乳糖-N-四糖	36.917	642.937	0.585	139.213	10	100	1.9872	29.44
	6'-唾液乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.9872	n.a.
	3'-唾液乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.9872	n.a.
样品2	3'-岩藻糖基乳糖	8.217	214.027	n.a.	74.426	10	100	1.988	n.a.
	乳糖二岩藻糖基四糖	9.817	339.541	0.539	106.587	10	100	1.988	27.11
	2'-岩藻糖基乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.988	n.a.
	乳糖-N-新四糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.988	n.a.
	乳糖-N-四糖	36.433	1056.743	1.026	113.921	10	100	1.988	51.61
	6'-唾液乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.988	n.a.
	3'-唾液乳糖	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	10	100	1.988	n.a.

3.3 精密度

取混合标准工作曲线第4点的工作液，在2.3.1的仪器条件下连续进6针测定，计算溶液中七种母乳低聚糖含量的RSD值，从而确定其重复性精密度。结果如下，方法精密度良好。

3.4.1 标准品重复性精密度

测试结果：

图4 标曲S4平行独立试验重叠谱图

表3 标准品重复性精密度

	保留时间	样品量
3'-岩藻糖基乳糖RSD%	0.496		0.183
乳糖二岩藻糖基四糖RSD%	0.731		0.707
2'-岩藻糖基乳糖RSD%	0.718		1.019
乳糖-N-新四糖RSD%	0.547		1.113
乳糖-N-四糖RSD%	0.728		1.128
6'-唾液乳糖RSD%	0.17		1.358
3'-唾液乳糖RSD%	0.18		1.19

3.5 检出限定量限

检出限：分别移取一定量标准溶液，稀释成10μg/L的 3'-岩藻糖基乳糖、30μg/L的乳糖二岩藻糖基四糖、30μg/L的2'-岩藻糖基乳糖、22μg/L的乳糖-N-新四糖、67μg/L的乳糖-N-新四糖、67μg/L的6'-唾液乳糖和160μg/L的3'-唾液乳糖混合标准溶液，配置20个平行样，上机测试。

定量限：分别移取一定量标准溶液，稀释成30μg/L的 3'-岩藻糖基乳糖、80μg/L的乳糖二岩藻糖基四糖、90μg/L的2'-岩藻糖基乳糖、65μg/L的乳糖-N-新四糖、200μg/L的乳糖-N-新四糖、200μg/L的6'-唾液乳糖和500μg/L的3'-唾液乳糖混合标准溶液，配置6个平行样，上机测试。

测试结果如下：

表4 七种母乳低聚糖检出限、定量限信噪比测试结果

样品名称	3'-岩藻糖基乳糖	乳糖二岩藻糖基四糖	2'-岩藻糖基乳糖	乳糖-N-新四糖	乳糖-N-四糖	6'-唾液乳糖	3'-唾液乳糖
检出限信噪比平均值	7.680	4.727	5.011	6.141	7.414	4.435	5.849
定量限信噪比平均值	31.214	15.723	16.733	25.384	24.892	26.428	28.380

3.6 特异性

往10mL容量瓶中分别加入100μL葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖标准溶液，用稀释67倍的样品2溶液定容至刻度，上机测试，检查是否会对七种母乳低聚糖出峰造成干扰，测试结果如下图所示，可看出四种糖对乳粉中七种母乳低聚糖检测无明显干扰。

图5 标曲S6、样品2溶液与样品2 溶液加入四种糖标准品重叠谱图

4.结论

本次验证使用英国365集团官网离子色谱仪验证食品中母乳低聚糖的测定方法。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，3'-岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻糖基四糖、2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、6'-唾液乳糖、3'-唾液乳糖均在60分钟内出峰，灵敏度符合国标要求，线性相关系数均大于0.999。标准品和样品重复性均较好，除两种唾液乳糖外，检出限和定量限均在μg/L级别，方法特异性良好，未发现干扰待测组分出峰的杂质，整体符合标准要求。

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