方案概述
前言：
硝基咪唑类药物是一类人工合成的抗菌抗原虫药物，对厌氧菌、滴虫等病原体具备优异抑制杀灭效果，过去曾被大量用于畜禽、水产养殖，用于防治动物消化道感染、原虫类疾病，起到疫病防控、提升养殖成活率的作用。但该类药物及其体内代谢产物具有明确的潜在毒性，进入动物体内后会发生快速代谢，生成多种活性代谢产物，部分代谢物在动物组织中滞留时间远长于母体药物。据毒理学研究表明，硝基咪唑类母体及其主要代谢物具备潜在致癌性、致突变性以及遗传毒性，动物源性食品中残留的硝基咪唑可通过食物链富集进入人体，长期低剂量摄入，会干扰人体造血功能，损伤染色体，提升基因突变风险，对人体健康构成潜在威胁。基于该安全风险，我国已明令禁止硝基咪唑类药物用于食品动物，不允许在动物性食品中检出我国已明确禁止其在动物性食品中使用，因此对动物性食品中硝基咪唑类药物残留开展精准检测，是保障食品安全、守护消费者健康的重要技术手段。
《食品安全国家标准 动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定 液相色谱串联质谱法》（GB 31658.23-2022）为该项目法定检测依据，规定了部分硝基咪唑类药物母体与代谢物在动物源食品中的最大残留量，适用于牛、羊、肉等动物性基质。本应方案采用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统，依据上述标准，对猪肉中四种硝基咪唑类药物残留进行检测，并对线性、检出限、定量限、回收率、精密度等进行性能验证。结果显示，各项指标均满足国标要求，搭建稳定可靠的残留筛查与确证方案，为食品安全风险监测提供技术支撑。
关键词：液相色谱串联质谱系统；猪肉；硝基咪唑。
1.仪器设备及试剂
1.1 液相串联质谱配置清单
表1 仪器配置清单表
|
序号 |
名称 |
数量 |
|
1 |
LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统 |
1台 |
|
2 |
P3500B 二元高压恒流泵 |
1台 |
|
3 |
CT3500 柱温箱 |
1台 |
|
4 |
AS3500 超高效自动进样器 |
1台 |
|
5 |
SmartLab CDS 2.0色谱工作站 |
1套 |
|
6 |
C18 1.6 μm 2.1x100 mm |
1个 |
1.2 试剂及标准品清单
表2 试剂及标准品清单表
|
序列 |
试剂及标准品 |
规格 |
|
1 |
甲醇 |
LC-MS级 |
|
2 |
乙腈 |
LC-MS级 |
|
3 |
甲酸 |
LC-MS级 |
|
4 |
4种硝基咪唑类外标混标 |
1000 mg/L |
|
5 |
4种硝基咪唑内标混标 |
1000 mg/L |
|
6 |
猪肉 |
- |
|
7 |
纯水 |
超纯水 |
|
8 |
乙酸乙酯 |
分析纯 |
|
9 |
盐酸 |
分析纯 |
|
10 |
正己烷 |
分析纯 |
|
11 |
氨水 |
分析纯 |
1.3 实验材料及辅助设备
超声波清洗机；
涡旋混合器；
高速离心机；
水浴加热；
氮吹仪；
分析天平。
2.实验方法
2.1 溶液配制
2.1.1 0.1 mol/L盐酸溶液:提取浓盐酸8.3mL，加水稀释到1L，混匀。
2.2.2 2%氨水溶液:去2mL氨水，加水稀释到100mL，混匀。
2.1.3 0.1%甲酸水溶液:取水500mL，加入500µL甲酸，混匀。
2.1.4 0.1%甲酸乙腈溶液:取乙腈500mL，加入500µL甲酸，混匀。
2.1.5 1µg/mL混合标准工作液:精密量取适量标准液于10mL容量瓶中，加入甲醇稀释到刻度，配制成浓度为1µg/mL的混合标准工作液。
2.1.6 1µg/mL混合内标工作液:精密量取适量内标标准液于10mL容量瓶中，加入甲醇稀释到刻度，配制成浓度为1µg/mL的混合内标工作液。
2.2 样品处理
2.2.1 提取
准确称取2g试样(精确到0.05g)于50mL离心管中，加入1µg/mL混合内标工作液10µL，涡旋30s，静置10min。加入乙酸乙酯15mL，涡旋2min，10000r/min，离心5min。取上清液于另一50mL离心管中，残渣中加入15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，于25℃水浴氮吹吹干。
2.2.2 净化
残余物中加入0.1mol/L盐酸溶液5mL，涡旋1min，加入正己烷5mL，振摇1min，5000r/min，离心5min，弃去正己烷层，下层再加入5mL正己烷重复除脂一次，弃正己烷层，下层液备用。
固相萃取柱依次用0.1mol/L盐酸溶液3mL，甲醇3mL活化，随后取备用液过柱，用3mL 0.1mol/L盐酸溶液淋洗后，加入4mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，在35℃水浴中氮气吹干，残余物中加入0.5mL水复溶，涡旋1min滤膜过滤，待上机测试。
2.3 液相方法条件
色谱柱：C18, 1.6 µm 2.1x100mm；
流动相：A相：0.1%甲酸水；B相：0.1%甲酸乙腈；
流速：0.3 mL/min；
柱温：40 ℃；
进样体积：4 µL。
2.4 梯度方法条件
表3 流动相梯度
|
时间(min) |
类型 |
A相：0.1% 甲酸水 |
B相：0.1% 甲酸乙腈 |
|
0 |
线性 |
95 |
5 |
|
0.5 |
线性 |
95 |
5 |
|
3 |
线性 |
5 |
95 |
|
4 |
线性 |
5 |
95 |
|
4.01 |
线性 |
95 |
5 |
|
8 |
线性 |
95 |
5 |
2.5 质谱方法条件
表4 质谱离子源参数
|
离子源 |
参数 |
|
离子源电压 |
ESI+4500V |
|
脱溶剂气流速 |
60psi |
|
雾化气流速 |
30psi |
|
气帘气流速 |
20psi |
|
碰撞气流速 |
8 |
|
脱溶剂气温度 |
500 ℃ |
|
气帘气温度 |
150 ℃ |
3.实验结果
3.1 标准品谱图
8分钟内完成四种硝基咪唑药物及其内标的测定，峰形良好，化合物响应良好，符合实验测定需求。
图1 四种硝基咪唑类药物色谱图（40 ng/mL）
3.2 线性范围
配制基质匹配标准曲线，取经提取和净化的猪肉空白基质提取液，加入适量的混合标准工作液和1µg/mL混合内标工作液10µL，35℃水浴氮吹吹干，加水0.5mL溶解，涡旋1min混匀。配制浓度为2µg/L、4µg/L、20µg/L、40µg/L、200µg/L、400µg/L的基质匹配标曲。
线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差20%，四种硝基咪唑类药物R²均大于0.9995，线性关系良好。
表5 四种硝基咪唑类药物线性范围
|
化合物 |
线性范围（ng/mL） |
R² |
|
甲硝唑 |
2-400 |
0.99995 |
|
羟基甲硝唑 |
2-400 |
0.99955 |
|
地美硝唑 |
2-400 |
0.99968 |
|
羟基地美硝唑 |
2-400 |
0.99991 |
表6 四种硝基咪唑类药物标准曲线图
|
化合物 |
标准曲线图 |
|
甲硝唑 |
|
|
羟基甲硝唑 |
|
|
地美硝唑 |
|
|
羟基地美硝唑 |
|
3.3 检出限与定量限
本方法中四种硝基咪唑类药物在空白基质（猪肉）加标浓度0.5µg/kg时信噪比远大于3，在1µg/kg浓度时信噪比远大于10。完全满足标准检出限为0.5µg/kg，定量限为1µg/kg要求，具体各浓度下不同目标物信噪比如下表。
表6 四种硝基咪唑类药物检出限与定量限
|
化合物 |
信噪比（0.5µg/kg） |
信噪比（1µg/kg） |
|
甲硝唑 |
358 |
480 |
|
羟基甲硝唑 |
78 |
196 |
|
地美硝唑 |
121 |
191 |
|
羟基地美硝唑 |
37 |
59 |
图3 四种硝基咪唑类药物空白基质加标（猪肉）色谱图（0.5µg/kg）
图4 四种硝基咪唑类药物空白基质加标（猪肉）色谱图（1µg/kg）
3.4 精密度
取猪肉空白基质样稀释四种硝基咪唑类药物标准工作液，使其最终浓度为2ng/mL，20ng/mL，连续进样6针比较精密度；结果如下表所示，2ng/mL浓度连续六针RSD均在6%以内，20ng/mL浓度连续六针RSD均在3%以内，符合标准的≤10%的精密度要求。
表7 四种硝基咪唑类药物精密度测试（n=6）
|
化合物 |
浓度（ng/mL） |
保留时间RSD |
含量RSD |
|
羟基甲硝唑 |
2 |
1.959 |
5.681 |
|
20 |
2.040 |
1.411 |
|
|
羟基地美硝唑 |
2 |
0.335 |
4.512 |
|
20 |
0.335 |
2.682 |
|
|
甲硝唑 |
2 |
0.242 |
3.164 |
|
20 |
0.269 |
1.402 |
|
|
地美硝唑 |
2 |
0.229 |
3.794 |
|
20 |
0.157 |
1.717 |
图5 四种硝基咪唑类药物2ng/mL精密度色谱图（n=6）
3.5 空白残留
取标准曲线最高点400ng/mL后进样空白试剂，计算其空白残留，远低于定量限（2ng/mL）的峰面积20%，符合测试需求。
图6 空白基质残留色谱图
3.6 回收率
样品加标回收率如下表所示，在空白样品基质中加入硝基咪唑标准溶液和内标溶液，使其浓度达到2ng/mL和20ng/mL加标浓度，经前处理后上机测试，结果为2ng/mL加标浓度回收率在61.8%~103.35%之间，20ng/mL加标回收率在104.35%~107.15%之间，满足标准要求60%~120%。
表8 四种硝基咪唑类药物加标回收率
|
化合物 |
加标浓度 (ng/mL) |
上机浓度 (ng/mL) |
平均回收率（n=6） |
|
羟基甲硝唑 |
2 |
1.574 |
78.70% |
|
20 |
21.43 |
107.15% |
|
|
羟基地美硝唑 |
2 |
1.236 |
61.80% |
|
20 |
21.33 |
106.65% |
|
|
甲硝唑 |
2 |
1.649 |
82.45% |
|
20 |
20.87 |
104.35% |
|
|
地美硝唑 |
2 |
2.067 |
103.35% |
|
20 |
21.23 |
106.15% |
3.7 猪肉样品测试
称取一定量猪肉经过前处理后进样，上机结果如下，四种硝基咪唑类药物均未检出。
图7 猪肉样品测试色谱图
4.结论
本方法使用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统，对猪肉中四种硝基咪唑类药物残留量测定。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合要求，R²均大于0.9995，精密度在10%以内，高浓度样本系统残留远低于定量限，加标回收率良好，说明了该方法配备英国365集团官网液相色谱串联质谱系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。
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