方案概述
前言
喹诺酮类抗生素，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类以抑制细菌DNA合成关键酶-DNA回旋酶和拓扑异构酶IV的活性，进一步阻止细菌的合成与复制，从而达到抗菌效果。喹诺酮类药物具有抗菌谱广、抗菌效果强、价格低廉、副作用低等特点，广受生产者和经营者的青睐。但该类药物在实际使用中易出现超量、超范围使用情况, 致使动物体内药物残留问题普遍存在。兽药残留一方面可通过动物的排泄进入环境，造成环境中兽药成分的增多；另一方面，兽药残留通过食物链蓄积在人体内，还会使人体产生耐药性、过敏反应等非正常生理反应。尤其，喹诺酮类抗生素对儿童骨骼发育的潜在风险而备受关注，其可能会引起儿童关节及软组织的损伤, 危害青少年的健康成长。因此对动物源性食品中喹诺酮类抗生素药物残留的检测已成为兽药研发以及食品安全控制中必不可少的重要环节。
我国食品安全国家标准《GB 31650-2019 食品中兽药最大残留限量》中规定部分喹诺酮类抗生素动物源食品中的兽药最大残留量；同时《GB 31658.17-2021 食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱－串联质谱法》中规定了13种喹诺酮类液质检测方法与方法定量限。本应⽤方案介绍了成功验证英国365集团官网LCMS-TQ9200 三重四极杆液质联用系统分析鸡肉中13种喹诺酮类抗生素残留的结果。
关键词：液质联用，喹诺酮，兽药残留，食品安全
1.设备仪器
英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统
2.液相方法
色谱柱：Kinetex 2.6 µm F5 3.0x100mm
流动相：A相：0.1%甲酸甲醇；B相：0.1%甲酸水
流速：0.4 mL/min
柱温：45 ℃
进样体积：3 µL
3.质谱方法
表1 质谱离子源参数
|
离子源 |
ESI，正离子模式 |
|
离子源电压 |
5500 V |
|
脱溶剂气流速 |
18000 mL/min |
|
雾化气流量 |
2000 mL/min |
|
气帘气流速 |
5000 mL/min |
|
碰撞气流量 |
800 µL/min |
|
脱溶剂气温度 |
450 ℃ |
|
气帘气温度 |
150℃ |
表2 各化合物质谱参数
|
化合物 |
Q1 |
Q3 |
去簇电压DP（V） |
碰撞能量CE(V) |
|
噁喹酸 |
262.1 |
244* |
100 |
25 |
|
160 |
100 |
50 |
||
|
氟甲喹 |
262.1 |
202 |
115 |
44 |
|
244.1* |
115 |
24 |
||
|
诺氟沙星 |
320.1 |
302.1* |
90 |
27 |
|
233.2 |
90 |
33 |
||
|
依诺沙星 |
321.2 |
234 |
100 |
38 |
|
303* |
100 |
30 |
||
|
环丙沙星 |
332.2 |
231* |
100 |
49 |
|
288 |
100 |
25 |
||
|
培氟沙星 |
334.1 |
316* |
110 |
29 |
|
233.2 |
110 |
35 |
||
|
洛美沙星 |
352.1 |
265.1* |
110 |
31 |
|
334 |
110 |
29 |
||
|
达氟沙星 |
358.1 |
340.1* |
100 |
32 |
|
283.1 |
100 |
32 |
||
|
恩诺沙星 |
360.2 |
316.1 |
110 |
27 |
|
245.1* |
110 |
38 |
||
|
氧氟沙星 |
362.1 |
318.3 |
75 |
25 |
|
261.2* |
75 |
34 |
||
|
麻保沙星 |
363.2 |
72.1* |
100 |
25 |
|
345.2 |
100 |
29 |
||
|
沙拉沙星 |
386.1 |
299.1* |
110 |
38 |
|
342 |
110 |
27 |
||
|
二氟沙星 |
400.2 |
299.1* |
120 |
40 |
|
382.2 |
120 |
30 |
注：带*为定量离子
4.实验结果
4.1 峰形
11分钟内完成13种喹诺酮类抗生素的测定，各峰均有良好的峰形，无喹诺酮类抗生素常见的峰形拖尾现象，各化合物响应良好，符合实验测定需求。
图1 13种喹诺酮类抗生素色谱图（10 ng/mL）
4.2 线性范围
取适量喹诺酮类混合标准溶液，逐级稀释到系列浓度制作标准曲线，线性范围2~500 ng/mL，线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²范围在0.9921~0.9998之间，各组分线性关系良好。
表3 线性范围表
|
化合物 |
线性范围 |
线性相关系数R² |
|
噁喹酸 |
2-500 ng/mL |
0.9989 |
|
氟甲喹 |
2-500 ng/mL |
0.9988 |
|
诺氟沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9968 |
|
依诺沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9989 |
|
环丙沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9982 |
|
培氟沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9992 |
|
洛美沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9921 |
|
达氟沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9969 |
|
恩诺沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9998 |
|
氧氟沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9941 |
|
麻保沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9997 |
|
沙拉沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9946 |
|
二氟沙星 |
2-500 ng/mL |
0.9973 |
图2 部分喹诺酮类线性结果
4.3 检测限与定量限
食品安全国家标准GB 31658.17-2021中规定方法检测限为 2 µg/kg，定量限为10 µg/kg。本方法中各化合物在2 µg/kg和10 µg/kg信噪比远大于3和10，符合国标中灵敏度要求。
表4 各化合物检测限与定量限信噪比
|
化合物 |
信噪比（S/N） |
|
|
2 µg/kg |
10 µg/kg |
|
|
噁喹酸 |
111.26 |
359.11 |
|
氟甲喹 |
59.64 |
244.73 |
|
诺氟沙星 |
70.16 |
392.57 |
|
依诺沙星 |
23.74 |
80.26 |
|
环丙沙星 |
37.91 |
99.26 |
|
培氟沙星 |
28.70 |
125.81 |
|
洛美沙星 |
48.54 |
165.84 |
|
达氟沙星 |
105.74 |
348.10 |
|
恩诺沙星 |
35.97 |
120.82 |
|
氧氟沙星 |
51.67 |
287.26 |
|
麻保沙星 |
190.11 |
399.38 |
|
沙拉沙星 |
38.11 |
160.79 |
|
二氟沙星 |
25.85 |
149.29 |
图3 部分喹诺酮类检测限与定量限色谱图
4.4 精密度
取10、50、100ng/mL三种浓度喹诺酮类标准物质混合溶液，连续进样6针比较保留时间与峰面积偏差，结果如下表所示，所有喹诺酮类化合物保留时间偏差均小于0.3%，峰面积偏差均小于5%，符合国标的RSD≤15%的精密度要求。
表5 此方法各化合物批内批间精密度
|
化合物 |
浓度(ng/mL) |
批内偏差RSD（%，n=6) |
批间偏差RSD(%) |
||
|
Day 1 |
Day 2 |
Day 3 |
|||
|
噁喹酸 |
10 |
1.773 |
2.941 |
3.198 |
4.601 |
|
50 |
3.220 |
1.857 |
1.927 |
2.576 |
|
|
100 |
3.483 |
2.937 |
3.002 |
3.701 |
|
|
氟甲喹 |
10 |
4.233 |
2.124 |
3.458 |
3.555 |
|
50 |
1.704 |
2.766 |
3.435 |
2.807 |
|
|
100 |
1.195 |
1.214 |
2.146 |
3.125 |
|
|
诺氟沙星 |
10 |
1.998 |
4.093 |
2.953 |
3.907 |
|
50 |
2.491 |
2.294 |
1.962 |
3.331 |
|
|
100 |
2.272 |
1.167 |
2.582 |
3.538 |
|
|
依诺沙星 |
10 |
2.604 |
4.900 |
4.691 |
4.490 |
|
50 |
3.139 |
3.619 |
1.346 |
2.863 |
|
|
100 |
3.117 |
2.391 |
3.088 |
3.811 |
|
|
环丙沙星 |
10 |
2.919 |
4.421 |
8.027 |
7.876 |
|
50 |
2.282 |
1.866 |
6.161 |
3.798 |
|
|
100 |
2.272 |
1.575 |
3.083 |
4.376 |
|
|
培氟沙星 |
10 |
4.820 |
2.988 |
3.928 |
4.228 |
|
50 |
1.809 |
3.810 |
1.884 |
4.232 |
|
|
100 |
3.377 |
2.151 |
2.490 |
3.019 |
|
|
洛美沙星 |
10 |
1.846 |
3.176 |
5.793 |
6.986 |
|
50 |
1.856 |
3.206 |
2.796 |
6.018 |
|
|
100 |
2.035 |
1.266 |
2.077 |
3.893 |
|
|
达氟沙星 |
10 |
2.607 |
2.400 |
2.935 |
2.792 |
|
50 |
1.542 |
2.741 |
1.986 |
2.276 |
|
|
100 |
1.791 |
2.301 |
2.707 |
3.236 |
|
|
恩诺沙星 |
10 |
3.333 |
7.720 |
5.462 |
5.701 |
|
50 |
1.834 |
2.480 |
1.947 |
4.573 |
|
|
100 |
1.995 |
2.445 |
2.872 |
2.858 |
|
|
氧氟沙星 |
10 |
3.088 |
5.451 |
3.422 |
7.199 |
|
50 |
2.140 |
1.521 |
1.255 |
5.127 |
|
|
100 |
3.831 |
2.315 |
1.263 |
2.631 |
|
|
麻保沙星 |
10 |
3.182 |
4.434 |
2.579 |
5.421 |
|
50 |
2.964 |
3.168 |
2.128 |
5.244 |
|
|
100 |
2.265 |
2.079 |
3.428 |
3.887 |
|
|
沙拉沙星 |
10 |
4.294 |
6.866 |
3.798 |
7.130 |
|
50 |
2.483 |
1.720 |
1.220 |
2.568 |
|
|
100 |
2.058 |
2.094 |
4.402 |
3.311 |
|
|
二氟沙星 |
10 |
5.024 |
3.201 |
3.924 |
9.615 |
|
50 |
2.545 |
2.739 |
1.769 |
4.125 |
|
|
100 |
2.234 |
4.301 |
2.293 |
4.378 |
|
图4 部分化合物精密度色谱图
5.结论
本方法使用英国365集团官网LCMS TQ9200液相质谱联用系统，进行鸡肉中喹诺酮类抗生素的测定。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合国标要求，线性相关系数均大于0.99，所有喹诺酮类化合物保留时间偏差均小于0.3%，峰面积偏差均小于5%，对制备的3批次鸡肉样品进行分析，3批次鸡肉样品中未检测到喹诺酮类抗生素残留。说明了该方法配备英国365集团官网液相色谱质谱联用系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。
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